PCR, ana DNA'yı şablon olarak ve spesifik primerleri uzatmanın başlangıç noktası olarak kullanarak, DNA polimerazın katalizi altında dNTP, Mg2+, uzama faktörleri ve amplifikasyon arttırma faktörlerinin sisteme eklenmesini ifade eden polimeraz zincir reaksiyonudur, Denatürasyon, tavlama, uzatma vb. adımları aracılığıyla, ana iplikçik şablon DNA'sını tamamlayıcı yavru iplikçik DNA'sını in vitro kopyalama süreci, herhangi bir hedef DNA'yı in vitro hızlı ve spesifik bir şekilde çoğaltabilir.
1. Sıcak Başlangıç PCR'si
Geleneksel PCR'de amplifikasyonun başlangıç zamanı PCR makinesini PCR makinesine koymak değildir ve daha sonra program amplifikasyona başlar.Sistem konfigürasyonu tamamlandığında spesifik olmayan amplifikasyona neden olabilecek amplifikasyon başlar ve sıcak başlangıçlı PCR bu sorunu çözebilir.
Sıcak başlangıç PCR nedir?Reaksiyon sistemi hazırlandıktan sonra, reaksiyonun ilk ısıtma aşamasında veya "sıcak başlangıç" aşamasında enzim değiştirici yüksek sıcaklıkta (genellikle 90°C'den yüksek) salınır, böylece DNA polimeraz aktive olur.Kesin aktivasyon süresi ve sıcaklığı, DNA polimerazın ve sıcak başlatma değiştiricinin doğasına bağlıdır.Bu yöntem esas olarak DNA polimerazın aktivitesini inhibe etmek için antikorlar, afinite ligandları veya kimyasal değiştiriciler gibi değiştiricileri kullanır.DNA polimeraz aktivitesi oda sıcaklığında inhibe edildiğinden, sıcak başlatma teknolojisi, PCR reaksiyonlarının özgüllüğünden ödün vermeden, oda sıcaklığında birden fazla PCR reaksiyon sisteminin hazırlanmasında büyük kolaylık sağlar.
2. RT-PCR
RT-PCR (Ters transkripsiyon PCR), mRNA'dan cDNA'ya ters transkripsiyona yönelik ve bunu amplifikasyon için bir şablon olarak kullanan deneysel bir tekniktir.Deneysel prosedür, önce doku veya hücrelerdeki toplam RNA'nın ekstrakte edilmesi, primer olarak Oligo (dT) kullanılması, cDNA'nın sentezlenmesi için ters transkriptaz kullanılması ve daha sonra hedef genin elde edilmesi veya gen ifadesinin saptanması amacıyla PCR amplifikasyonu için cDNA'nın şablon olarak kullanılmasıdır.
3. Floresan kantitatif PCR
Floresan kantitatif PCR (Gerçek Zamanlı Kantitatif PCR,RT-qPCR), tüm PCR sürecini gerçek zamanlı olarak izlemek için floresan sinyallerinin birikimini kullanarak ve son olarak şablonu niceliksel olarak analiz etmek için standart eğriyi kullanarak PCR reaksiyon sistemine floresan grupları ekleme yöntemini ifade eder.Yaygın olarak kullanılan qPCR yöntemleri arasında SYBR Green I ve TaqMan bulunur.
4. İç içe PCR
Yuvalanmış PCR, iki tur PCR amplifikasyonu için iki set PCR primerinin kullanımını ifade eder ve ikinci turun amplifikasyon ürünü, hedef gen fragmanıdır.
Birinci primer çiftinin (dış primerler) uyumsuzluğu spesifik olmayan bir ürünün amplifikasyonuna neden olursa, aynı spesifik olmayan bölgenin ikinci primer çifti tarafından tanınması ve amplifikasyona devam etmesi olasılığı çok düşüktür, dolayısıyla İkinci primer çifti ile amplifikasyonla PCR'nin özgüllüğü geliştirildi.İki tur PCR gerçekleştirmenin bir avantajı, sınırlı başlangıç DNA'sından yeterli ürünün çoğaltılmasına yardımcı olmasıdır.
5. Konma PCR'si
Touchdown PCR, PCR döngüsü parametrelerini ayarlayarak PCR reaksiyonunun özgüllüğünü iyileştirmeye yönelik bir yöntemdir.
Touchdown PCR'de ilk birkaç döngünün bağlanma sıcaklığı, primerlerin maksimum bağlanma sıcaklığının (Tm) birkaç derece üstüne ayarlanır.Daha yüksek tavlama sıcaklığı, spesifik olmayan amplifikasyonu etkili bir şekilde azaltabilir, ancak aynı zamanda daha yüksek tavlama sıcaklığı, primerlerin ve hedef dizilerin ayrılmasını şiddetlendirerek PCR veriminin azalmasına neden olur.Bu nedenle, ilk birkaç döngüde, sistemdeki hedef genin içeriğini artırmak için tavlama sıcaklığı genellikle döngü başına 1°C düşecek şekilde ayarlanır.Tavlama sıcaklığı optimum sıcaklığa indirildiğinde tavlama sıcaklığı kalan çevrimler boyunca korunur.
6. Doğrudan PCR
Doğrudan PCR, nükleik asit izolasyonu ve saflaştırmaya gerek kalmadan hedef DNA'nın doğrudan örnekten amplifikasyonunu ifade eder.
İki tür doğrudan PCR vardır:
direkt yöntem: az miktarda numune alın ve bunu PCR tanımlaması için doğrudan PCR Master Mix'e ekleyin;
kırma yöntemi: numuneyi aldıktan sonra lizata ekleyin, genomu serbest bırakmak için parçalayın, az miktarda parçalanmış süpernatan alın ve bunu PCR Master Mix'e ekleyin, PCR tanımlamasını yapın.Bu yaklaşım deneysel iş akışını basitleştirir, uygulamalı zamanı azaltır ve saflaştırma adımları sırasında DNA kaybını önler.
7. SOE PCR'si
Örtüşme uzatma PCR'si (SOE PCR) yoluyla gen birleştirme, PCR ürünlerinin örtüşen zincirler oluşturmasını sağlamak için tamamlayıcı uçlara sahip primerler kullanır, böylece sonraki amplifikasyon reaksiyonunda, örtüşen zincirlerin uzatılması yoluyla, güçlendirilmiş fragmanların üst üste bindiği farklı A tekniği kaynakları sağlanır. ve birbirine eklenmiş.Bu teknolojinin şu anda iki ana uygulama yönü vardır: füzyon genlerinin oluşturulması;gen bölgesine yönelik mutasyon.
8. IPCR
Ters PCR (IPCR), iki primer dışındaki DNA fragmanlarını amplifiye etmek için ters tamamlayıcı primerleri kullanır ve bilinen bir DNA fragmanının her iki tarafındaki bilinmeyen dizileri amplifiye eder.
IPCR başlangıçta bitişik bilinmeyen bölgelerin dizisini belirlemek için tasarlandı ve çoğunlukla gen promoter dizilerini incelemek için kullanıldı;gen füzyonu, translokasyon ve transpozisyon gibi onkogenik kromozomal yeniden düzenlemeler;ve viral gen entegrasyonu da artık yaygın olarak kullanılmaktadır. Bölgeye yönelik mutajenez için, istenen mutasyona sahip bir plazmid kopyalayın.
9.dPCR
Dijital PCR (dPCR), nükleik asit moleküllerinin mutlak miktarının belirlenmesine yönelik bir tekniktir.
Nükleik asit moleküllerinin miktarının belirlenmesi için şu anda üç yöntem vardır.Fotometri, nükleik asit moleküllerinin absorbansına dayanır;gerçek zamanlı floresan kantitatif PCR (Gerçek Zamanlı PCR), Ct değerini temel alır ve Ct değeri, tespit edilebilecek floresans değerine karşılık gelen döngü numarasını ifade eder;dijital PCR, nükleik asit miktarının sayımı için tek moleküllü PCR yöntemini temel alan en son Kantitatif teknolojidir. Mutlak kantitatif bir yöntemdir.
Gönderim zamanı: Haziran-13-2023