Ultrafiltrasyon santrifüj tüpünün kullanımı ve önlemleri
1) Uygun bir ultrafiltrasyon tüpü seçin.UF membranlarının çeşitli kimyasallara karşı tolerans düzeylerinin farklı olduğunu unutmayın.Tipik olarak, 10 kDa moleküler ağırlık sınırına sahip ultrafiltrasyon tüpleri, 35 kDa gibi ilgili proteinin moleküler ağırlığının 1/3'ünden daha büyük olmaması gereken bir moleküler ağırlık kesimiyle seçilebilir.İlgilenilen proteinin moleküler ağırlığı 10 kd civarındaysa, moleküler ağırlık sınırı 3 KD olan bir ultrafiltrasyon tüpü kullanılabilir.
(2) Yeni satın alınan ultrafiltrasyon kurudur, kullanımdan önce ultra saf su eklenir ve su membrandan, buz banyosundan veya buzdolabından tamamen geçirilir ve birkaç dakika önceden soğutulur.Daha sonra su, yani protein sıvısı boşaltılır ve tüpün tepesindeki beyaz çizgiden hangisi daha fazla değilse ne kadar eklenir.İşlem hafiftir ve protein çözeltisini eklemeden önce ultrafiltrasyon tüpünün buz üzerinde önceden soğutulması gerekir.
3) Hem kütlenin hem de ağırlık merkezinin dengeye ulaşması gerekiyordu.Dönme hızının ve ivmenin çok hızlı olmadığını, aksi halde doğrudan ultrafiltrasyon membranına zarar vereceğini unutmayın.Santrifüjlü ultrafiltrasyon başlatıldı (santrifüj önceden 4 dereceye soğutuldu).Farklı santrifüjlerin RPM'si g'ye dönüştürüldükten sonra farklıydı.Santrifüjün hızlanması minimuma ayarlanarak membran üzerindeki basınç azaltıldı.Not: Santrifüj hedef hızına ulaştıktan sonra mutlaka santrifüjden ayrılınız, aksi halde ilk seferde halledemeyecekseniz sorun yaşarsınız.Membranın mile oryantasyonu talimatlara göre ayarlandı (açısal santrifüj kasası membrandan eksene diktir).Pratik kullanımda genel dönüş hızı talimatlarda belirtilenden daha düşüktür, böylece santrifüj tüpünün ömrü uzatılabilir.
3) Hem kütlenin hem de ağırlık merkezinin dengeye ulaşması gerekiyordu.Dönme hızının ve ivmenin çok hızlı olmadığını, aksi halde ultrafiltrasyon membranına doğrudan zarar verdiğini unutmayın.Santrifüjlü ultrafiltrasyon başlatıldı (santrifüj önceden 4 dereceye soğutuldu).Farklı santrifüjlerin RPM'si g'ye dönüştürüldükten sonra farklıydı.Santrifüjün hızlanması minimuma ayarlanarak membran üzerindeki basınç azaltıldı.Not: Santrifüj hedef hızına ulaştıktan sonra mutlaka santrifüjden ayrılınız, aksi halde ilk seferde halledemeyecekseniz sorun yaşarsınız.Membranın mile oryantasyonu talimatlara göre ayarlandı (açısal santrifüj kasası membrandan eksene diktir).Pratik kullanımda genel dönüş hızı talimatlarda belirtilenden daha düşüktür, böylece santrifüj tüpünün ömrü uzatılabilir.
(4) Kalan 1 ml'ye kadar konsantre edildiğinde, 50 ul tampon solüsyonu alın, 10 ul akış ekleyin ve ultrafiltrasyon tüpünde protein eksik olup olmadığına karar vermek için herhangi bir mavi renk olup olmadığına bakın.Tüp sızdırıyorsa üst katmanı yeniden dökün ve ultrafiltrasyonu başlatmak için yeni bir tüpe akıtın.Tüplerin atlanıp atlanmadığını kesin olarak belirlemek için, akıştan önce 5 mgml BSA ile 10 dakika süreyle santrifüjleyin, protein tutkalı veya Bradford ham tahlili üzerinde çalıştırın ve kalan konsantre protein çözeltisini (buz üzerinde çalışan ve proteinlerin ısınmasını önleyen) ekleyerek devam edin. konsantrenin tamamı eklenmiştir.Santrifüj sırasında protein çökelmesi meydana gelirse ve tüpün kapanmasına neden olursa dikkatli olun.Çökelme meydana gelirse, çökeltinin spesifik nedeninin aşırı protein konsantrasyonu mu yoksa uygun olmayan bir tampon mu olduğunu belirleyin;İlki, birden fazla ultrafiltrasyon tüpünün eşzamanlı olarak ultrafiltrasyonu yoluyla, konsantrasyonun azaltılmasıyla ve ikincisi, protein çökelmesi oluşmayıncaya kadar farklı tampon çözeltilerinin değiştirilmesiyle çözülebilir.
(4) Kalan 1 ml'ye kadar konsantre edildiğinde, 50 ul tampon solüsyonu alın, 10 ul akış ekleyin ve ultrafiltrasyon tüpünde protein eksik olup olmadığına karar vermek için herhangi bir mavi renk olup olmadığına bakın.Tüp sızdırıyorsa üst katmanı yeniden dökün ve ultrafiltrasyonu başlatmak için yeni bir tüpe akıtın.Tüplerin atlanıp atlanmadığını kesin olarak belirlemek için, akıştan önce 5 mgml BSA ile 10 dakika süreyle santrifüjleyin, protein tutkalı veya Bradford ham tahlili üzerinde çalıştırın ve kalan konsantre protein çözeltisini (buz üzerinde çalışan ve proteinlerin ısınmasını önleyen) ekleyerek devam edin. konsantrenin tamamı eklenmiştir.Santrifüj sırasında protein çökelmesi meydana gelirse ve tüpün kapanmasına neden olursa dikkatli olun.Çökelme meydana gelirse, çökeltinin spesifik nedeninin aşırı protein konsantrasyonu mu yoksa uygun olmayan bir tampon mu olduğunu belirleyin;İlki, birden fazla ultrafiltrasyon tüpünün eşzamanlı olarak ultrafiltrasyonu yoluyla, konsantrasyonun azaltılmasıyla ve ikincisi, protein çökelmesi oluşmayıncaya kadar farklı tampon çözeltilerinin değiştirilmesiyle çözülebilir.
(5) İlk birkaç adım proteini konsantre etmek için kullanılır ve eğer tampon değiştirilecekse, yaklaşık 1 ml toplam proteine yavaşça yeni tampon ekleyin (0,22 um ultrafiltrasyon membranından ultrafiltrasyon) ve üç dakika boyunca yaklaşık 1 ml'ye kadar yeniden konsantre edin. Arzu edilen protein konsantrasyonuna bağlı olarak nihai konsantre nihai hacim ile ardışık kez, genellikle 500 ul'den fazla değil, aynı zamanda 200 ul dahilinde.Her seferinde en az 10 kat veya daha fazla hacim zenginleştirmesi ile hesaplanan miktardaki tampon değişimini, üç durumda 1000 kat veya daha fazlasını elde edin.
(5) İlk birkaç adım proteini konsantre etmek için kullanılır ve eğer tampon değiştirilecekse, yaklaşık 1 ml toplam proteine yavaşça yeni tampon ekleyin (0,22 um ultrafiltrasyon membranından ultrafiltrasyon) ve üç dakika boyunca yaklaşık 1 ml'ye kadar yeniden konsantre edin. Arzu edilen protein konsantrasyonuna bağlı olarak nihai konsantre nihai hacim ile ardışık kez, genellikle 500 ul'den fazla değil, aynı zamanda 200 ul dahilinde.Her seferinde en az 10 kat veya daha fazla hacim zenginleştirmesi ile hesaplanan miktardaki tampon değişimini, üç durumda 1000 kat veya daha fazlasını elde edin.
Gönderim zamanı: Kasım-09-2022